Die Entdeckung und Weiterentwicklung von RNA-gesteuerten Nukleasen haben die molekulare Biologie und Genomforschung fundamental verändert. Die CRISPR-Cas9-Technologie steht dabei stellvertretend für den Durchbruch in der genetischen Manipulation. Doch trotz der starken Effizienz und Vielseitigkeit von Cas9 stoßen Forscher auf Herausforderungen wie die Größe der Cas9-Proteine, ihre Spezifität sowie die sichere Anwendung in vivo. Vor diesem Hintergrund bildet das evolutionär geführte Design des IscB-Proteins einen bedeutenden Fortschritt für die nachhaltige und präzise Epigenom-Editierung. IscB ist ein kleines, RNA-gesteuertes Nukleaseenzym, das als evolutiver Vorläufer des Cas9-Komplexes gilt. Es stammt aus einem Bakterium des menschlichen Mikrobioms und hat merkmalsbedingt eine kompakte Proteinstruktur mit etwa 300 bis 550 Aminosäuren.
Diese Kompaktheit ermöglicht eine bessere Verpackung und Auslieferung in lebende Zellen, insbesondere durch virale Vektoren wie Adeno-assoziierte Viren (AAV), die aufgrund ihrer begrenzten Kapazität stets eine wichtige Herausforderung bei der Gentherapie darstellen. Ein zentrales Problem bei traditionellen IscB-Systemen war bisher die vergleichsweise geringe Spezifität, die durch kurze effektive Bindungslängen der guide RNA bedingt ist. Während Cas9 typischerweise längere Guide-Sequenzen von etwa 17 bis 20 Basenpaaren nutzt, beschäftigen IscB-Systeme üblicherweise Guides von nur 12 bis 15 Basenpaaren. Kürzere Guides bieten eine geringere Möglichkeit für exakte Zielerkennung, was potenziell zu Off-Target-Effekten führt. Daher lag ein Schwerpunkt der aktuellen Forschung auf der Verlängerung der effektiven Bindungslänge der ωRNA, die IscB bei der DNA-Erkennung unterstützt. Die Herangehensweise, die Forscher für die Optimierung von IscB wählten, war evolutionär und strukturgeleitet.
Dabei wurden orthologe Varianten des IscB in der Natur, die bereits unterschiedliche funktionelle Eigenschaften besitzen, systematisch untersucht und kombiniert. Diese orthologe Screening-Strategie ermöglichte es, Varianten zu identifizieren, die bereits von Natur aus bessere Aktivität und spezifische Eigenschaften aufweisen. Ein Beispiel hierfür ist das OrufIscB, ein IscB-Ortholog aus humanrelevanten Metagenomen, das eine deutlich höhere Indel-Aktivität (Insertionen und Deletionen) an menschlichen Genomen erreichte als die früheren Varianten. Darüber hinaus nutzten Wissenschaftler fortgeschrittene Proteinstruktur-Vorhersagemodelle wie AlphaFold2, um die dreidimensionale Struktur von IscB und verwandten Proteinen zu modellieren. So konnten sie gezielt bestimmte Proteinabschnitte, insbesondere die REC-Domäne (Recognition Domain), identifizieren und durch Domänen-Swapping oder gezielte mutagenetische Modifikationen die spezifische Bindung an das DNA-Guide-RNA-Duplex verbessern.
Der REC-Domänen-Einschub ermöglicht eine stabilere und längere Erkennung des Ziel-DNA-Strangs und trägt so zur Verbesserung der Spezifität bei. Das entwickelte Protein NovaIscB weist diese REC-Domäne auf und zeigt in Experimenten eine bis zu 100-fach gesteigerte Effizienz im Vergleich zu dem ursprünglichen OgeuIscB. Neben der Proteinmodifikation spielte auch die Optimierung der ωRNA eine bedeutende Rolle. Die ωRNA ist ein leitender RNA-Molekülanteil, der das IscB-Enzym zu seiner Zielsequenz lenkt. Durch die Strukturaufklärung konnte die ωRNA auf ihre wesentlichen funktionalen Bereiche reduziert und zugleich in ihrer Stabilität verbessert werden. Diese Trunkierung ermöglichte unter anderem eine vierfache Erhöhung der RNA-Expression in menschlichen Zellen und machte die ωRNA auch kompakt genug für eine mögliche chemische Synthese.
Die Kombination aus einer optimierten ωRNA und dem verbesserten NovaIscB-Protein ergibt ein hocheffizientes und spezifisches Ribonukleoproteinkomplex, der für Anwendungen in vivo geeignet ist. Ein weiterer innovativer Aspekt der Forschung war die Entwicklung eines kontrollierbaren Systems durch Verwendung sogenannter transRNAs, die eine bedingte Aktivierung des IscB-Systems ermöglichen. Durch das Aufsplitten der ωRNA an einer nicht essentiellen Stelle und die Reaktivierung in trans kann das Enzym nur bei vorliegender vollständiger ωRNA aktiviert werden. Dies bietet zusätzliche Sicherheitsmechanismen und eine zeitliche Steuerung der Genom-Editierung. Der kompakte Aufbau und die verbesserte Spezifität von NovaIscB eröffnen insbesondere innovative Möglichkeiten für die Epigenom-Editierung in lebenden Organismen.
Die Forscher konnten NovaIscB mit DNA-Methyltransferasen und Transkriptionsrepressoren fusionieren, um gezielte und dauerhafte epigenetische Veränderungen an menschlichen und murinen Zelllinien zu bewirken. Das System, unter dem Namen OMEGAoff bekannt, ermöglichte eine stabile Gen-Suppression ohne die Einführung von DNA-Doppelstrangbrüchen, was das Risiko unerwünschter Mutationen minimiert und eine schonendere Herangehensweise an die Genom-Intervention darstellt. Im Gegensatz zu klassischen Gen-Schäden, die durch Nukleasen verursacht werden, greifen epigenetische Editoren in die Regulation des Gens ein, indem sie z. B. DNA-Methylierung an Promotorregionen erhöhen und somit die Genexpression unterdrücken. Die Kombination aus dem effizienten NovaIscB-System und den epigenetischen Effektorproteinen ist dank ihrer kompakten Größe innerhalb eines einzigen AAV-Vektors verpackbar, was die In-vivo-Anwendung in Tiermodellen ermöglicht.
Tatsächlich gelang es den Forschern, die Expression des therapeutisch relevanten Pcsk9-Gens in der Leber von Mäusen nach einer einzigen AAV-Verabreichung mehrere Monate lang signifikant zu unterdrücken. Diese Ergebnisse zeigen das Potenzial für eine langfristige epigenetische Therapie gegen Krankheiten, die durch Überexpression bestimmter Gene verursacht werden, wie Hypercholesterinämie und andere metabolische Erkrankungen. Ein wesentlicher Vorteil der evolutionär und strukturgeleitet entwickelten NovaIscB-Systeme liegt in der hohen Detailspezifität, die zur Minimierung von Off-Target-Effekten entscheidend ist. Durch umfangreiche Detektionstechniken, unter anderem tagmentation-basierte Tag-Integration (TTISS), konnten Forscher zeigen, dass NovaIscB bei Verwendung von 20-Nukleotid-Guides so spezifisch arbeitet wie das bewährte SpCas9-System.
Diese präzise Erkennung ist besonders wichtig für klinische Anwendungen, da unerwünschte Veränderungen im Genom gefährlichen Mutationen oder Funktionsverlusten verursachen können. Insgesamt hebt die Entwicklung von NovaIscB durch die Kombination natürlicher Proteinvielfalt mit rationalem Design und modernen Strukturvorhersagemethoden ein neues Paradigma in der Proteinengineering-Forschung hervor. Diese Methodik kann nicht nur auf IscB angewendet werden, sondern bietet ein generelles Instrumentarium zur Verbesserung der Aktivität und Spezifität von Enzymen für eine Vielzahl von biotechnologischen und therapeutischen Anwendungen. Zukunftsperspektiven sehen vor, die PAM-/TAM-Erkennungsspezifität von NovaIscB weiter zu lockern, um ein noch breiteres Spektrum an Zielsequenzen ansprechen zu können und somit die Anwendbarkeit weiter auszudehnen.
Zudem könnten neuartige Fusionsproteine mit anderen funktionellen Domänen für Base Editing, Prime Editing oder transkriptionsbasierte Modulation entwickelt werden. Die kompakte Größe erlaubt zudem die Nutzung in spezialisierten RNA-basierten Therapien und ermöglicht neue Programmieransätze für zielgezielte Genregulation in klinischen Settings. Die evolutionär geführte Proteinentwicklung von IscB markiert einen wichtigen Schritt auf dem Weg zu sicheren, effizienten und anpassbaren molekularen Werkzeugen, die das Potential haben, die Genommedizin entscheidend zu verändern und neue Therapieformen für bislang schwer behandelbare Erkrankungen bereitzustellen.
