Die moderne Biotechnologie erlebt einen rasanten Fortschritt, insbesondere im Bereich der Gen- und Epigenom-Editierung. Eine der jüngsten und vielversprechendsten Entwicklungen ist das evolutionär geführte Design des Proteins IscB, das als kompakter, RNA-gesteuerter Nuklease-Effektormolekül neue Perspektiven für präzise epigenetische Eingriffe in lebenden Organismen eröffnet. Mit einem stark verkürzten Protein-Maßstab bei gleichzeitig verbesserter Aktivität und Spezifität markiert IscB einen wichtigen Schritt in Richtung effizienter und sicherer Genomeditierung, vor allem für therapeutische Anwendungen in vivo. IscB steht in der Verwandtschaft des bekannten CRISPR-Cas9-Systems und repräsentiert die evolutionäre Vorläuferklasse dieser weit verbreiteten Genome-Editing-Technologie. Seine kompakte Struktur, bestehend aus etwa 300 bis 550 Aminosäuren, ermöglicht im Vergleich zu klassischen Editoren wie SpCas9 eine signifikant einfachere Verpackung und Auslieferung, beispielsweise durch Adeno-assoziierte Viren (AAVs).
Dieses Merkmal macht IscB besonders attraktiv für Anwendungen, bei denen die Größe und Effizienz des Editier-Instruments begrenzende Faktoren sind, wie in der Gentherapie oder komplexen In-vivo-Studien. Die Herausforderung bei der Optimierung von IscB lag dabei nicht nur in der Erhöhung seiner Aktivität, sondern vor allem in der Verfeinerung seiner Spezifität gegenüber der Ziel-DNA, um Off-Target-Effekte, die unerwünschte Mutationen verursachen könnten, zu minimieren. Frühere Varianten zeigten zwar ansehnliche Wirkung, doch oft auf Kosten der Genauigkeit. Durch eine Kombination aus systematischem Screening natürlicher IscB-Orthologe und fortschrittlichen Methoden der Proteinstruktur-Vorhersage und -Modifikation gelang es Forschern, die variant NovaIscB zu entwickeln. Diese Variante zeichnet sich durch eine bis zu 100-fach gesteigerte Aktivität auf menschlichen Genomen aus und übertrifft damit sowohl Wildtypformen als auch bisherige Engineering-Modelle deutlich, während sie gleichzeitig eine verbesserte Erkennungslänge für RNA-Leitsequenzen aufweist, was die Zielgenauigkeit weiter erhöht.
Ein entscheidender Fortschritt wurde durch die gezielte Integration und Modifikation des sogenannten REC-Domänensegments erreicht – ein Bereich des Proteins, der direkt mit dem RNA-DNA-Heteroduplex interagiert und so die Erkennungsspezifität maßgeblich beeinflusst. Die ursprünglichen IscB-Varianten zeigten hier eine begrenzte Kontaktfläche und damit eine reduzierte Kontrolle über die Bindung an die Zielsequenz. Durch die Übernahme REC-Elemente aus verwandten Cas9-Proteinen und strategische Veränderung von Proteinloops innerhalb dieser Domäne konnte die Effektivität von NovaIscB signifikant gesteigert werden. Diese Entwicklung stützt sich auf moderne KI-gestützte Strukturvorhersagewerkzeuge wie AlphaFold, die präzise Modelle der Proteinfaltung liefern und die rationale Proteinmodifikation erleichtern. Neben dem Protein selbst wurde auch die begleitende ωRNA, welche IscB beim Finden der Zielsequenz unterstützt, umfassend optimiert.
Die Reduktion der RNA-Länge um knapp 60 Nukleotide wurde auf Basis von Strukturinformationen vorgenommen, wobei kritische strukturelle Elemente erhalten blieben. Dies führte nicht nur zu einer kleineren Baugröße, sondern auch zu einer deutlich erhöhten Expression und Stabilität in menschlichen Zellen – entscheidende Faktoren für Anwendungen mit limitierter Transfektionseffizienz oder bei der Herstellung von AAV-Vektoren. Die neue Konstellation aus optimiertem NovaIscB-Protein und verkürzter ωRNA wurde auch als Teil eines vielseitigen Miniatur-Editiersystems namens OMEGAoff implementiert, das DNA-Methyltransferase-Domänen zur gezielten Veränderung epigenetischer Marker wie DNA-Methylierung nutzt. Diese Fusion erlaubt die Programmierung langfristiger Genstilllegungen ohne den Einsatz von DNA-Doppelstrangbrüchen oder Nuklease-vermittelten Schnitten, was mögliche Nebenwirkungen reduziert und die Sicherheit bei therapeutischen Eingriffen erhöht. Die einzigartige Kompaktheit des Systems ermöglichte zudem die effiziente Verpackung komplexer Editierkonstrukte inklusive Protein und Leit-RNA in einzelne AAV-Vektoren, was für die klinische Anwendung essenziell ist.
In präklinischen Modellen, insbesondere bei Mäusen, konnte OMEGAoff mit NovaIscB erfolgreich eingesetzt werden, um in der Leber das klinisch relevante Gen Pcsk9 epigenetisch zu repressieren – mit anhaltenden Effekten über mehrere Monate nach einer einzigen AAV-Injektion. Dabei wurde eine signifikante Senkung des Serum-PCSK9-Proteinspiegels sowie des Cholesterinspiegels beobachtet, ohne dass toxikologische Nebenwirkungen festzustellen waren. Diese Ergebnisse stellen einen Meilenstein für die Anwendbarkeit präziser epigenomischer Eingriffe in vivo dar. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass NovaIscB-basierte Systeme flexibel modifizierbar sind und auch als Basis für weitere molekulare Werkzeuge wie Adeninbase-Editoren oder Transkriptionsaktivatoren dienen können. Diese Modularität eröffnet ein breites Feld an Anwendungen, angefangen von gezielter Genkorrektur über das Herstellen fein abgestimmter Expressionsprofile bis hin zur Modellierung komplexer epigenetischer Zustände.
Ein weiterer Vorteil von IscB liegt in seiner potenziell reduzierten Immunogenität, da der Ursprung dieses Proteins im menschlichen Darmmikrobiom verortet ist, was das Risiko unerwünschter Immunantworten bei therapeutischer Nutzung mindern könnte. Diese Eigenschaft unterstreicht das Potenzial von NovaIscB als Kandidat für die Entwicklung sicherer Gentherapien. Trotz der vielversprechenden Eigenschaften des neuen Systems bestehen weiterhin Herausforderungen. Die Erfassung und Minimierung möglicher Off-Target-Effekte erfordert umfassende Analysen mit unterschiedlichen Methoden. Auch die Erweiterung der sogenannten TAM-Spezifität, also der erforderlichen DNA-Motivsequenz für die Zielerkennung, bleibt ein Schlüsselpunkt, um den Zielbereich im Genom noch weiter zu vergrößern.
